岡山理科大学　平成28,29年度プロジェクト研究推進事業

再生医療のための巨大筋組織作製技術の開発
　細胞や細胞からなる組織を体内に移植して病気を治療するのが再生医療である。現在の再生医療では万能細胞や分化した細胞を患部に移植する治療やシート状に培養した細胞を患部に貼り付ける治療が行われ、従来の薬品による治療では治せなかった疾患でも治療することができるようになった。今後はより多くの疾患の治療に応用するための研究が進められていく。事故などで筋組織が欠如した場合には厚みのある筋組織が求められる。筋組織に限らず、心臓や肝臓、膵臓等を再建するためには5 mm以上の厚みのある組織が必要とされる。厚い組織を作製するためには中心部に酸素や栄養分を行き渡らせる工夫が必要である。そこで、血管内皮細胞を混入して組織中に毛細血管を自発的に形成させて厚い組織を作製する研究が多く行われているが、毛細血管らしき構造ができるのに時間がかかるために、現在研究されている技術ではせいぜい1 mm程度の厚さが限界であり、5 mm以上の厚さの組織を人工的に作製する技術は未だにない。そこで本研究では、独自の考えにより厚さ1 cm以上の巨大筋組織を作製する技術を開発することを目的とする。

　巨大筋組織を作製するには以下の5個の技術を開発する。全ての技術は他者の研究にはない独創的なアイディアで構成されている。

(1)足場材料の開発　厚みのある組織を作製するにはコラーゲンなどで厚みのあるゲルを作製し、それを足場として細胞を培養する。血管内皮細胞をゲルに混入し、流れの刺激を与えるか酸素やグルコースの濃度勾配を作製するとその血管内皮細胞が凝集して管状の構造を形成する。しかし、血管内皮細胞がゲル中を移動するのに時間がかかるため、予め毛細血管の様な管網を有する足場材料を作製して使用すれば、早期に毛細血管を作製することができると考えられる。

(2)培養容器の開発　巨大組織を培養容器に接着させずに培養液中に浮遊させなければならないのはもちろんであるが、巨大組織を定期的に伸展させることにより組織中の培養液の流動を発生させ、酸素と栄養分を組織の中心に効率的に供給できると考えられる。また、そのための培養容器を開発する必要がある。

(3)細胞の改質　巨大組織の中心部を壊死させないためには、組織中に酸素と栄養を送り届けるとともに細胞自身の酸素利用能を高めることが重要である。細胞のミトコンドリア活性を高めることにより酸素を使った好気的なエネルギー生産を促すことができる。ミトコンドリアを増やすことは筋肉の分化をも促進させ、収縮機能をより高める効果が期待できる。

(4)培養液浄化方法の開発　巨大組織中には大量の細胞が存在するため、培養液中に老廃物やエンドトキシンなどの毒素が溜まりやすい。老廃物や毒素を浄化・排出する培養システムを作製して使用すれば細胞の生育環境を良くすることができ、巨大組織を作製できる可能性が高くなると考えられる。

(5)効率的細胞分化方法の開発　筋組織は筋芽細胞をゲル等の足場材料中に大量に増殖させた後にその細胞を筋細胞に分化させることにより作製する。培養液中に混入する血清（細胞増殖作用がある）を減らして筋芽細胞を分化させる方法が用いられているが、効率が悪く、多くの筋細胞を作製するには時間がかかりすぎる。血清中には細胞膜を維持するのに必要なリポ蛋白も含まれているため、それが少ない状態が長く続くと分化した細胞も死んでしまう可能性がある。そのため、力学的刺激、化学的刺激等により効率よく筋芽細胞を分化させる方法を開発する必要がある。

　以上の課題を各教員が有するシーズを活用して解決し、最終的に開発した技術を組み合わせることにより巨大な筋組織を作製することを目指す。本プロジェクトから巨大組織の培養法に関する基盤技術が確立されれば、筋肉だけでなく、現在臓器構築の研究が進む肝臓、膵臓、腎臓、腸管、中枢神経系など幅広い分野に対して有益な情報をもたらすと考えられ、その研究意義は深い。

　プロジェクトメンバー
  • 内貴　猛　（工学部　生命医療工学科・教授）　研究代表者　
  • 猶原　順　（工学部　生命医療工学科・教授）
  • 神吉　けい太　（工学部　生命医療工学科・准教授）
  • 松浦　宏治　（工学部　生命医療工学科・准教授）
  • 岩井　良輔　（技術科学研究所・講師）

　研究成果概要
　厚さ1 cm以上の巨大筋組織を作製する技術を開発することを目的に、(1)毛細血管の様な管網を有する足場材料、(2)巨大組織を培養ディッシュに接着させずに定期的に伸展させることができる培養用器、(3) 細胞のミトコンドリア活性を高める方法、(4)培養液浄化方法、(5)効率的な筋芽細胞分化方法等の基盤技術を開発するための研究を実施し、各基盤技術を進展させた。

(1) ひも状細胞組織をゲル中で血管状に変形させるための方法の確立
(2) 周期的に0.5 mm間隔でマイクロポアを有する厚さ0.1-0.3 mmのシリコーンシートの製作
(3) ミトコンドリア生合成促進が細胞分化、エネルギー産生、酸素消費量におよぼす影響の検討
(4) 枯草菌や大腸菌以外の微生物に対するUV-LED照射の殺菌効果の検討
(5) 筋芽細胞の分化速度におよぼす低酸素と低栄養の影響の検討

　研究業績
　(1)学術論文
  1. Oyama K, Kanki K, Shimizu H, Kono Y, Azumi J, Toriguchi K, Hatano E, Shiota G. Impact of Preferentially Expressed Antigen of Melanoma on the Prognosis of Hepatocellular Carcinoma. Gastrointestinal Tumors. 3:128-135, 2017査読有

  2. Shimizu H, Tsubota T, Kanki K, Shiota G. All-trans retinoic acid ameliorates hepatic stellate cell activation via suppression of thioredoxin interacting protein expression. Journal of Cellular Physiology 2017 Mar 21. doi: 10.1002/jcp.25921　査読有.

  3. Iwai R, Haruki R, Nemoto Y, Nakayama Y, Induction of cell self-organization on weakly positively charged surfaces prepared by the deposition of polyion complex nanoparticles of thermoresponsive, zwitterionic copolymers. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, Volume 105(5): 1009-1015, 2017査読有

  4. Iwai R, Nemoto Y, Nakayama Y, Preparation of 3D cell culture models for drug screening using cell-self aggregation inducible coating material, 岡山理科大学技術科学研究所年報　第35号: 9-13, 2017査読無

  5. Iwai R, Nemoto Y, Nakayama Y, Preparation and characterization of directed, one-day-self-assembled millimeter-size spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells, Journal of Biomedical Materials Research Part A 104(1): 3005-3012, 2016 査読有

  6. Koji Matsuura, Ikuyo Sugimoto, Yuka Kuroda, Koji Kadowaki, Michiya Matsusaki, Mitsuru Akashi, Development of microfluidic systems for fabricating cellular multilayers, Analytical Sciences, 32 (2016) 1171-1176.　査読有

  7. Yokogi S, Tsubota T, Kanki K, Azumi J, Itaba N, Oka H, Morimoto M, Ryoke K, Shiota G.　Wnt/Beta-Catenin Signal Inhibitor HC-1 Sensitizes Oral Squamous Cell Carcinoma Cells to 5-Fluorouracil through Reduction of CD44-Positive Population.　Yonago Acta Med. 59(2):93-9, 2016 査読有

  8. Okada T, Kimura A, Kanki K, Nakatani S, Nagahara Y, Hiraga M, Watanabe Y. Liver Resident Macrophages (Kupffer Cells) Share Several Functional Antigens in Common with Endothelial Cells. Scand J Immunol. 83:139-50, 2016査読有


　(2)学会（その他）発表
　
  1. 植村仁、神吉けい太、肝癌細胞におけるイソクエン酸脱水素酵素の発現とその転写調節因子の解析　第24回肝細胞研究会、2017年7月1日, 旭川市.

  2. 岩井良輔、細胞の自己集合化誘導技術の開発と気管組織再構築への応用、第26回硬組織再生生物学会（招待特別講演）、2017年8月19日、岡山市

  3. 岩井良輔、長島諒、神吉けい太、中山泰秀、細胞の自己集合化技術を用いた生体模擬立体細胞構造体の作製と培養皿への固定化: 次世代の創薬試験用培養モデル"Body on a Chip"の実現に向けて、第44回日本毒性学会学術年会、2017年7月10日、横浜市

  4. 岩井良輔, 細胞を自動的に集めて3次元の組織体を作製する技術～再生医療と創薬試験用途を指向した培養皿の開発～、第22回OUS技術セミナー、2017年2月17日、岡山市

  5. 岩井良輔、細胞の自己集合を誘導する培養皿の開発と再生医療およひ?創薬を指向した立体細胞組織体の作製、第22回岡山リサーチパーク展示研究発表会、2017年1月18日、岡山市

  6. 岩井良輔, 根本泰､中山泰秀、細胞の自己集合化表面（CAT）を基盤とする３次元組織構築の要素技術開発：形状とサイズ制御、大量生産化、第54回日本人工臓器学会大会、2016-11-23,25、米子市.

  7. 岩井良輔、細胞が自発的に集合し3次元組織化する培養表面の開発: 再生医療への応用、OUSフォーラム2016、 医療ステーション3（一般）, 2016-11-11, 岡山市.

  8. 岩井良輔、細胞が自発的に集合し3次元組織化する培養表面の開発: 創薬試験への応用、OUSフォーラム2016、 医療ステーション3（一般）,、2016年11月11日、岡山市

  9. Yuka Asano, Koji Matsuura, Keiji Naruse, Comprehensive analyses of gene expression patterns in early mouse early embryos experiencing chemical and mechanical stimuli, Mechanobiology of Disease, 2016年9月29日、シンガポール

  10. 植村仁、神吉けい太、イソクエン酸脱水素酵素の発現を指標にした細胞分化関連転写因子の探索　OUSフォーラム2016, 2016年11月11日, 岡山市.

  11. 猶原順、UV-LEDを利用した殺菌装置の提案、第２１回岡山リサーチパーク研究・展示発表会、2017-1-18,19、岡山.

  12. 猶原順、竹原優衣、浦上逸男、UV-LEDを利用した殺菌装置の提案、OUSフォーラム2016、2016-11-11、岡山.

  13. 猶原順、岡田尚士、浦上逸男、UV-LEDによる殺菌効果特性、OUSフォーラム2016、2016-11-11、岡山.

  14. 渡部拓也，内貴猛、筋芽細胞の分化初期段階における表面硬さとアクチン線維の変化、第29回バイオエンジニアリング講演会、2017-1-19,20、名古屋市．


　(3)図書
　　　
  1. Koji Matsuura, Saori Nishina, Yuka Asano, Recent Advances in Microfluidic Diagnostic and Treatment Systems for Assisted Reproductive Technologies in Developing Countries, Chapter 4, IAPC-OBP, in press.

  2. 内貴猛、保崎尚哉、渡部拓也、温熱・繰り返し伸展刺激・細胞分化による細胞スティフネスの変化、「高度物理刺激と生体応答」、養賢堂、印刷中．

  3. 岩井良輔、中山泰秀、バイオ・医療への3Dプリンティング技術の開発最前線「細胞の自己組織化による3次元組織体の作製」、シーエムシー・リサーチ、2017年2月